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整合课程基础实验(分子与细胞分册)
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整合课程基础实验(分子与细胞分册)

作者：王应雄，卜友泉
出版社：科学出版社出版时间：2022-01-01
开本： 其他 页数： 244
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整合课程基础实验(分子与细胞分册) 版权信息

  • ISBN：9787030496126
  • 条形码：9787030496126 ; 978-7-03-049612-6
  • 装帧：一般胶版纸
  • 册数：暂无
  • 重量：暂无
  • 所属分类：
    自然科学
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整合课程基础实验(分子与细胞分册) 内容简介

本书是“以器官-系统为主线”的高等医学院校：“5+3”临床医学专业医学整合课程实验系列教材的一部分，对传统开设的生物化学、分子生物学、细胞生物学和医学遗传学四门课程的实验内容进行了有机整合。全书分为基本实验操作及常用仪器使用、经典验证性实验、综合性实验和创新性实验共四章。教材内容新颖，体系完整，有所侧重，便于选择。

整合课程基础实验(分子与细胞分册) 目录

目录
**章 基本实验操作及常用仪器使用 1
**节 常用研究技术 1
第二节 基本实验操作 24
第三节 常用仪器使用 32
第四节 实验室规则及安全防护 43
第五节 如何撰写实验报告 44
第二章 经典验证性实验 46
**节 蛋白质定量分析实验 46
实验一 微量凯氏定氮法测定蛋白质含量 46
实验二 双缩脲法测定血清蛋白质含量 49
实验三 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 50
实验四 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 52
实验五 BCA法测定蛋白质浓度 54
第二节 层析实验 56
实验六 纸层析法观察转氨基作用 56
实验七 葡聚糖凝胶柱层析分离血红蛋白与鱼精蛋白 58
实验八 离子交换层析分离混合氨基酸 60
实验九 薄层层析分离鉴定氨基酸 61
第三节 电泳实验 64
实验十 血清醋酸纤维薄膜电泳 64
实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 67
实验十二 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量 72
第四节 酶学实验 74
实验十三 血清碱性磷酸酶活性测定 75
实验十四 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定 77
实验十五 胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素 79
实验十六 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 82
实验十七 Hg2+对脲酶的抑制作用 84
实验十八 酶米氏常数的测定 86
第五节 糖与脂质 87
实验十九 血糖浓度的测定 88
实验二十 肾上腺素对血糖浓度的影响 90
实验二十一 血清三酰甘油浓度测定 91
实验二十二 血清总胆固醇浓度测定 94
实验二十三 血清载脂蛋白apoA1的测定 98
实验二十四 血清过氧化脂质的测定 99
实验二十五 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 101
第六节 核酸分离纯化技术 102
实验二十六 基因组DNA的提取制备与检测 102
实验二十七 全血基因组DNA的试剂盒法提取制备与检测 106
实验二十八 总RNA的提取制备与检测 108
实验二十九 质粒DNA的提取制备与检测 111
实验三十 动物组织核酸的提取及成分鉴定 115
第七节 PCR技术 117
实验三十一 常规PCR技术 117
实验三十二 定量PCR技术 120
第八节 基因克隆技术 123
实验三十三 凝胶中DNA片断的纯化回收 123
实验三十四 DNA的限制性酶切与电泳 124
实验三十五 DNA连接实验 127
实验三十六 感受态细胞的制备 130
实验三十七 重组DNA转化与蓝白斑筛选 131
第九节 分子杂交与印迹技术 133
实验三十八 核酸原位杂交 133
实验三十九 Southern印迹杂交 139
实验四十 Northern印迹杂交 142
实验四十一 Western印迹 145
第十节 细胞结构 147
实验四十二 动植物细胞的基本形态与结构及细胞显微测量 147
实验四十三 细胞内几种细胞器的观察 151
实验四十四 小白鼠巨噬细胞吞噬实验 152
实验四十五 细胞内几种化学成分的显示 153
实验四十六 细胞骨架系统的显示与观察 155
实验四十七 细胞膜的通透性的观察 157
第十一节 细胞增殖 158
实验四十八 细胞融合实验 158
实验四十九 细胞有丝分裂观察 159
实验五十 细胞原代培养 161
实验五十一 细胞传代培养 163
实验五十二 培养细胞的冻存、复苏与运输 163
第十二节 医学遗传 164
实验五十三 人类某些遗传性状的观察及皮肤纹理分析 165
实验五十四 人类染色体照片核型分析 171
实验五十五 染色体G显带染色体的核型分析 173
实验五十六 人类染色体镜下核型分析 176
第三章 综合性实验 178
实验一 血清γ-球蛋白的分离纯化及鉴定 178
实验二 碱性磷酸酶的分离纯化与动力学研究 183
实验三 hCS基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及鉴定 187
实验四 hCS基因在毕赤酵母中的表达及鉴定 192
实验五 荧光原位杂交实验 195
实验六 用双荧光素酶报告基因检测启动子活性 198
实验七 电泳迁移阻滞实验 201
实验八 染色质免疫沉淀 205
实验九 蛋白质双向电泳 209
实验十 肝癌组织的代谢组学分析 214
实验十一 酵母双杂交实验 218
实验十二 RNA干扰实验 220
实验十三 人类外周血染色体标本的制备观察 224
实验十四 人类恶性肿瘤染色体标本的制备观察 225
实验十五 羊水细胞培养及染色体标本的制备观察 226
实验十六 人精子染色体标本制备 228
实验十七 绿色荧光蛋白标记的融合蛋白转染及观察 230
第四章 创新性实验 231
实验一 重要蛋白质或酶的分离纯化 231
实验二 家族性高胆固醇血症的诊断 231
实验三 血友病的分子诊断 233
实验四 RNA干扰技术靶向沉默目的基因 233
实验五 家系调查和遗传病的系谱分析 234
实验六 药物诱导肿瘤细胞凋亡的检测实验 236
主要参考文献 237
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整合课程基础实验(分子与细胞分册) 节选

**章 基本实验操作及常用仪器使用 **节 常用研究技术 一、分光光度技术 每种物质均具有特异性的吸收光谱，不同物质由于分子结构的差异，对不同波长光线的吸收能力不同。凡是以光吸收、发射和散射等作用而建 立起来的光分析方法，称为光谱分析法。分光光度技术就是一种常见的光谱分析方法，它利用物质特有的吸收光谱，对物质进行定性及定量的鉴定 分析。它不仅可应用于可见光，还可以扩展到紫外和红外光谱。对于未经分离纯化的复杂样品，分光光度技术可直接检测出其中极少量的物质成分 ，体现出高灵敏度、高精确度和快速简便的特点。目前，分光光度技术已经成为生物化学工作中不可或缺的常用技术之一。 (一)基本原理 光由光量子组成，具有波-粒二相性，即不连续的微粒和连续的波动性。光的本质就是电磁波，分光光度法所使用的光谱范围在200～10 000nm 之间。其中200～400nm为紫外光区，400～760nm为可见光区，760～10 000nm为红外光区。分光光度技术的定量依据是比尔-朗泊(Beer-Lambert)定 律，简称比尔定律，也称为光吸收定律。当一束平行单色光通过一定液层厚度的有色溶液时，由于溶质吸收了光能，光的强度就会减弱。溶液浓度 越大，液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的就越多，光强度的减弱现象越明显。比尔定律正好描述了有色溶液对单色光的吸收程度与溶液及 液层厚度间的定量关系，即溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。用公式表示： A=E×C×L (1-1) 式中，A为吸光度；E为吸光系数；C为溶液浓度；L为液层厚度；E是各物质在一定波长下的特征常数，可反映物质对光吸收的灵敏程度。E值越 大，表示该物质对此波长的光吸收能力越强。 比尔定律适用于有色溶液和均匀非散射的吸光物质(包括液体、气体和固体)，是各类分光光度法的定量依据。 (二)分光光度计基本结构 从含有各种波长的混合光中分离并测量单色光强度的仪器称为分光光度计。由于分光光度计采用具有辐射连续光谱的光源，不同波长的分子吸 收光谱的强弱存在差异。因此，根据不同波长设计的分光光度计具有各自的用途和测定范围，常用于测定分子光谱的分光光度计有三大类，即紫外 分光光度计，可见光分光光度计和红外分光光度计。另外，还有万用(全波段)分光光度计。分光光度计由下列五部分组成，包括光源、单色器、狭 缝、样品池、检测器和显示器。 1. 光源 光谱仪器使用的光源配置的光源，必须提供所需波长范围的连续光谱，并具备足够的输出功率和良好的稳定性。 常用的紫外光源有氢灯和氘灯，分别发射波长在190～360nm和180～500nm之间的光谱。由于氘灯辐射能量比氢灯大约4倍，使用寿命也比氢灯 长，目前大多数紫外分光光度计都使用氘灯。 常用的可见光光源有碘钨灯、钠灯和疝灯等。钨灯发射连续波长的范围在320～2500nm之间；钠灯发射连续波长的范围在400～10 000nm之间； 疝灯发射连续波长的范围在250～700nm之间。 常用的红外光光源有纳恩斯特(Nernst)棒，这是一种通过电加热使温度达到1500～2000℃之间的惰性材料。它的检测波长范围在750～1 000 000nm之间。 2. 单色器 能将连续复合光源分解成单一波长的单色光或者具有一定宽度谱带的分光器，称为单色器。单色器由分光器和狭缝等色散元件组成 。 单色器由棱镜或者光栅构成。棱镜的分光原理是，当一束平行光进入棱镜散射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光。经聚焦镜聚焦后 ，在聚焦面的不同位置上成像，就得到按波长展开的光谱。光学玻璃棱镜，主要用于可见分光光度计或红外分光光度计；石英玻璃棱镜主要用于紫 外分光光度计；人造蓝宝石棱镜，其用途与石英玻璃棱镜相同。棱镜的特点是波长越短，色散程度越好。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在 紫外区可达0.2nm，而在长波段只能达到5nm。光栅利用光的衍射和干涉原理进行分光，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光， 于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。光栅单色器的性能优劣取决于光栅的材料和 单位面积上刻的条纹数量，刻得越多则分辨率越高。 3. 狭缝 狭缝是单色器的重要组成部分，直接影响仪器的分辨率。狭缝由两块锋利金属刀片(一块弧形，一块直形)组成，两刀片之间严格平行 。由此在光通路上形成狭隙，将来自单色器的散射光切割成单色光，调节入射单色光的纯度和强度。狭缝越大，采集光的面积越大，光的单色性越 差。反之，则光的单色性越好。狭缝可在0～2mm宽度内调节，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。 4. 样品池 样品池也叫做比色杯或比色皿，由透明材料制成，比如硅酸盐玻璃、有机玻璃、石英玻璃或其他晶体材料。不同的检测波长可选用 不同材料制成的比色杯，例如在紫外光波区检测可选用石英玻璃比色杯，在可见光波区可选用普通光学玻璃比色杯，在中红外和远红外光波区可选 用无机盐晶体材料制成的比色杯。样品池用来盛放溶液，每个样品池壁厚度等规格应尽可能完全相同，否则将产生测量误差。 5. 检测器 检测器也被称为光电转换器，主要功能是将光信号转变为电信号，再通过放大器把信号输送给显示器。检测器必须在一个较广的波 长范围内对辐射信号都有响应，尤其在低功率辐射时对辐射能的吸收要更敏感，对辐射的响应更快，转换的电信号容易放大，产生的噪声要小，生 成的信号与入射光强度成正比。 光子响应检测器又分为光电光检测器、光电倍增管检测器、二极管列阵检测器。其中，光电管是由密封在玻璃管或石英玻璃管内的两个金属电 极组成，包括一个阴极和一个阳极。光电管的光谱响应特性取决于阴极上的涂层材料，不同阴极材料制成的光电管使用光谱范围不同，在不同的波 区测定光谱辐射，需选择不同的光电管。阴极是用对光敏感的金属(比如碱土金属的氧化物)制成。光越强，电子放出越多，由于电子带负电，被吸 引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。分光光度计采用电子倍增光电管，在光电管的阴极和阳极之间增加了若干倍增电极，故 在光照射下产生的电流比其他光电管要大很多，因此可提高测定的灵敏度。 6. 显示器 显示器是将检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟数字结果，再以一定方式显示出来。模拟输出装置包括电流表、电压表、记 录器、示波器、计算机联用等。一般多功能的精密分光光度计大多数采用软件配套的计算机显示。 (三)分光光度计的基本应用 1. 利用标准管测定溶液物质的含量 可见和紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。含量测定时所用波长通常要选择被测物质的*大 吸收波长。这样做的好处是检测灵敏度大，物质在含量上的细微变化都将引起吸光度的明显改变，并且可避免其他物质的干扰。 对已知浓度的标准管和测定管进行同样的处理和显色，分别读取吸光度，再根据公式(1-1)计算测定管中物质的含量，计算过程如下： A1 ＝ E1C1L1 A2 ＝ E2C2L2 (1-1) 其中A1和A2分别表示标准溶液和未知浓度溶液的吸光度，C1和C2分别表示标准溶液和未知浓度溶液的物质浓度，L1和L2分别表示盛放标准溶液 和未知浓度溶液比色杯的内径长度。其中L1=L2，故将上述两个公式改写为： A1/(E1C1)＝ A2/(E2C2)(1-2) 鉴于标准溶液和待测溶液中的物质相同，故E1=E2，将公式(1-2)简写为： C2 ＝(A2/A1)× C1(1-3) 考虑到标准溶液和待测溶液的体积相同，将公式(1-3)简写为： m2 ＝(A2/A1)×m1(1-4) 其中m1和m2分别表示标准溶液和待测溶液中物质的含量，应用公式(1-4)可计算出待测溶液中物质的含量m2。 2. 绘制标准曲线测定溶液物质的含量 对一组梯度浓度的标准管处理显色后，读取每管吸光度。以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 标准曲线，在选定浓度范围内标准曲线应为直线。然后，在与标准管相同处理的条件下，测定未知浓度溶液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相 对应的浓度。 一般而言，标准曲线的浓度范围在待测物质浓度的0.5～2倍之间，对应的吸光度应在0.05～1.00之间。另外，应在同一台仪器上进行标准曲线 的绘制与应用，绘制的标准曲线仅供短期使用，否则结果存在误差。 3. 通过摩尔吸光率推算溶液物质的浓度 比尔定律公式中的E为吸光系数，当溶液浓度C为1mol/L，液层厚度L为1cm时，E值等于摩尔消光率， 用ε表示，单位为L/(mol cm)。ε是物质的特征常数之一，由物质的性质与光波长决定。同一物质在不同的波长所测得的ε值不同，一般采用ε 值*大的波长进行比色测定。 读取液层厚度为1cm时的溶液吸光度，结合已知的ε值，根据公式(1-5)推算出待测溶液的物质浓度： C ＝ A/ε(1-5) 该方式是紫外吸收法测定蛋白质溶液含量的基础。蛋白质在280nm波长处有*大吸光值，其高低与蛋白质中赖氨酸和色氨酸的含量有关，故同 样浓度不同类型的蛋白质在280nm波长处具有不同的吸光值。在一定条件下，蛋白质的摩尔吸光率是一个恒定值。测出待测蛋白质溶液的吸光值， 即可根据公式1-5推算出待测蛋白的浓度。 紫外分光光度计适用于单一组分的物质或两个组分组成的混合物(两者的吸收峰完全独立)的定量分析，但对于存在某些干扰杂质的样品，则需 进行校正。例如，蛋白溶液中若混有核酸成分，则需采用280nm/260nm的吸光度比值校正，才能确定溶液中蛋白质的实际含量。 4. 测定混合物中各组分的浓度 面对含有2种或2种以上组分的待测溶液，根据各组分吸收光谱的重叠程度，选择不同的测定方法。例如，待测 溶液各组分的吸收峰互不干扰，则可按照单一组分测定方法分别测定各组分的浓度；各组分的吸收峰相互重叠，则可在多波长的光照射下，分别测 定其波长处溶液的表观吸光度，然后建立联合方程式，通过解方程获得各组分的浓度。 5. 鉴定化合物的种类 使用分光光度计可绘制吸收光谱曲线。方式是采用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一 种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。各种物质具有特定的吸收光谱曲线，因此 可通过吸收光谱曲线图鉴定化合物。特定化合物在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，吸收高峰和低峰的波长是固定 不变的。 紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析，比如用于蛋白质的定量分析(如前所述)。紫外线吸收是由化合物中的不饱和结构 造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一化合物的紫外吸收光谱应完全一致。值得注意的是，具有相同吸收光谱的 化合物其结构不一定相同。因此紫外吸收光谱分析需和其他方法结合起来确定化合物的种类。 (张莹) 二、电泳技术 在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极方向以一定的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，称为电泳。在一定条件下，混合物 中各组分的大小、携带电荷等不同，在同一电场下经过一段时间的泳动，就可有效的分离各组分。电泳技术就是由各种带电颗粒在电场中迁移率不 同而进行分离的一种技术。生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散于溶液中，它们所携带的静电荷主要取决于基质的H+浓度。以蛋白质 分子为例，蛋白质分子具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，在一定非等电点条件下，就会解离带电，蛋白质分子的性质和溶液的pH及离子强度 共同决定了它的带电的性质和电荷量 。带电的蛋白质分子在电场中就会朝着其所带电荷相反的方向移动，

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